Современные методы микроскопических исследований - Скачать Реферат - Рефераты - Phaeto

Современные методы микроскопических исследований — Скачать Реферат — Рефераты — Phaeto

Реферат: Световая микроскопия

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность — это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.

Контраст изображения — это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 — 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света — цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива -интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.

Методы световой микроскопии

Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения — разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля и его разновидности

Метод тёмного поля в проходящем свете ( Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Читайте также:  Микробиологическое исследование мочи Посев мочи, Чувствительность к антибиотикам

Проведение темнопольного исследования

Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

Устанавливают свет по Келеру;

Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;

На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;

Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;

Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;

С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);

Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.

Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол — конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Метод фазового контраста

Метод фазового контрастаи его разновидность — т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

Набора объективов со специальными фазовым пластинками;

Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.

Настройка фазового контраста заключается в следующем:

Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;

Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой «0»);

Настраивают свет по Келеру;

Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

Вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики — инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор — сверху.

Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Читайте также:  Обезболивающие при беременности при зубной боли - какие можно

Метод интерференционного контраста

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста — они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста – это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.

Метод исследования в свете люминесценции

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

7. Понятие о поляризационной микроскопии

Рассматривая прозрачные биологические объекты в световом микроскопе, трудно выявить некоторые структуры, поэтому приходится применять некоторые специальные методики, в частности – поляризационную микроскопию.

Поляризационный микроскоп аналогичен обычному биологическому микроскопу, но перед конденсором имеется поляризатор, а в тубусе между объективом и окуляром расположен анализатор. Предметный столик может вращаться вокруг своей оси.

Если скрестить поляризатор и анализатор, то поле зрения будет темным. Таким же оно останется после помещения на предметный столик изотропных прозрачных тел. Анизотропные предметы изменяют поле зрения в соответствии с тем влиянием, которое они оказывают на направление плоскости колебаний поляризованного света.

Так как некоторые ткани (мышечная, костная, нервная) обладают анизотропией, то возможна поляризационная микроскопия биологических объектов. При скрещенных поляризаторе и анализаторе будут видны только те структуры, анизотропия которых изменяет поляризованный свет.

Поляризованный свет можно использовать в модельных условиях для оценки механических напряжений, возникающих в костной такни. Этот метод основан на явлении фотоупругости, которое заключается в возникновении оптической анизотропии в первоначально изотропных твердых телах под влиянием механических нагрузок.

Из прозрачного изотропного материала, например – плексигласа, создают плоскую модель кости. В скрещенных поляроидах эта модель выглядит темной. Прикладывая нагрузку, вызывают анизотропию плексигласа, что становится заметным по характерной картине полос и пятен. По этой картине, а также по ее изменению при увеличении или уменьшении нагрузок можно судить о механических напряжениях, возникающих в модели, а следовательно, и в натуре.

Выводы и заключение

Сегодня мы познакомились с такими важными явлениями волновой оптики, как интерференция и поляризация света. Вы видите, что эти явления достаточно широко используются в технике и медицине. На следующей лекции мы познакомимся со следующим важным явлением волновой оптики – с дифракцией света и узнаем много нового о таком хорошо известном вам приборе как световой микроскоп.

Читайте также:  Бензоксония хлорид Лидокаин (Benzoxonii chloridum Lidocainum)- описание вещества, инструкция, примен

Поляризационная микроскопия реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии, профессиональной патологии, пульмонологии и онкологии.

Известен способ обнаружения кристаллов кварца при силикозе с помощью поляризационной микроскопии, который позволяет обнаружить анизотропные кристаллы кварца в пылевых скоплениях. Кристаллы кварца игловидной или округлой формы в поляризованном свете дают яркое свечение белого цвета. Поляризационная микроскопия находит широкое применение для обнаружения пылевых частиц в ткани легких и лимфоузлов. Преимуществами метода поляризационной микроскопии тканевых образцов являются простота, доступность, малые затраты времени для проведения исследования, которое рекомендуется проводить параллельно с обычной микроскопией гистологических препаратов (Diseases accociated with exposure to silica and nonfibrous silicate minerals. Arch Pathol Lab Med. 1988 Jul;112(7):673-720).

Недостаток — известный метод описан для морфологической диагностики силикоза (пневмокониоза, вызванного воздействием пыли, содержащей свободный диоксид кремния). Цветовая характеристика пылевых структур в поляризованном свете при алюминозе (бокситовом пневмокониозе) в литературе не представлена. Способ морфологической диагностики алюминоза (бокситового пневмокониоза) легких с помощью поляризационной микроскопии в литературе не описан.

В качестве ближайшего аналога нами выбран метод обнаружения структур, содержащих алюминий в легочной ткани с помощью трансмиссионной электронной микроскопии с рентгеновской спектроскопией, описанный в Mineralogical analysis of the respiratory tract in aluminium oxide-exposed workers. C.Voisin, F. Fisekci, B. Buclez, A. Didier, B. Couste, F. Bastien, P. Brochard, J-C. Pairon. European Respiratory Journal ISSN 0903 — 1936 Ltd 1996.

Недостаток — известный метод трудоемкий, дорогостоящий, требует специальной подготовки материала и затрат времени на исследование.

Заявляемый способ направлен на морфологическую диагностику и верификацию профессиональной пылевой патологии — алюминоза (бокситового пневмокониоза) легких. Заболевания органов дыхания, ассоциированные с ингалированной минеральной пылью, в

первую очередь пневмокониозы занимают существенное место в современной пульмонологии. Верификация профессиональной пылевой патологии является сложной и ответственной задачей, так как гиподиагностика профессиональной патологии ущемляет права больного на компенсационные выплаты и не способствует развитию профилактических мероприятий на производстве.

Технический результат: способ позволяет идентифицировать в гистологических срезах структуры, содержащие алюминий, которые в поляризованном свете обладают свечением оранжевого цвета и имеют преимущественно округлую или овальную форму. Идентификация структур, содержащих алюминий в легочной ткани, необходима для подтверждения диагноза алюминоз (бокситовый пневмокониоз) легких. Внедрение способа диагностики алюминоза (бокситового пневмокониоза) на материале резекций или биопсийном материале легких способствует совершенствованию диагностики профессиональных пылевых поражений органов дыхания.

Заявляется способ морфологической диагностики алюминоза (бокситового пневмокониоза) на материале резекций или биопсийном материале легких и лимфатических узлов, отличающийся тем, что наличие алюминия в пылевых частицах определяют с помощью микроскопа по свечению оранжевого цвета в поляризованном свете.

Изобретение поясняется иллюстрациями.

На Фиг.1 показано скопление пылевых частиц темно-коричневого цвета в ткани легкого. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение 200.

На Фиг.2 показано свечение оранжевым цветом частиц, содержащих алюминий.

Поляризационная микроскопия, увеличение 200.

На Фиг.З показаны структуры, содержащие алюминий. Сканирующая электронная микроскопия.

На Фиг.4 показано картирование алюминия по площади образца. Сканирующая электронная микроскопия с энергодисперсионным микроанализом пылевых частиц.

На Фиг.5 показан рентгеноспектральный микроанализ пыли в ткани легких. Сканирующая электронная микроскопия с энергодисперсионным микроанализом пылевых частиц.

Способ диагностики алюминоза (бокситового пневмокониоза) легких осуществляется с применением биологического микроскопа (или поляризационного микроскопа) с использованием поляризационных фильтров, позволяющих перейти из режима обычной световой микроскопии в режим работы в поляризованном свете без

перемещения гистологического среза на предметном столике микроскопа. В поляризованном свете определяются структуры, обладающие свойством двулучепреломления. Поляризационная микроскопия позволяет обнаружить анизотропные структуры и кристаллы в пылевых скоплениях, что имеет существенное диагностическое значение при пылевых поражениях органов дыхания, в первую очередь профессиональной природы (пневмокониозы). В зависимости от длины световой волны, проходящей через кристалл, в поляризованном свете определяется свечение разного цветового спектра. При алюминозе (бокситовом пневмокониозе) в поляризованном свете определяются анизотропные структуры, содержащие алюминий и кристаллы кварца. Частицы алюминия обладают низким показателем двулучепреломления и в поляризованном свете имеют свечение оранжевого цвета (Фиг. 1, 2).

Проверено и доказано наличие в составе пыли соединений алюминия методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с энергодисперсионным микроанализом (Фиг.3-5). Метод СЭМ проведен на базе УЦКП «Современные нанотехнологии» ИЕНиМ, Уральского Федерального Университета, образцы изучали в сканирующем электронном микроскопе AURIGA FIB-SEM workstation («Carl Zeiss & МТ», Германия). Известный метод СЭМ с энергодисперсионным микроанализом является трудоемким, требует материальных затрат в проведении метода, производстве и обслуживании оборудования, имеется сложность эксплуатации техники, необходима высокая квалификация для подготовки образца и проведения исследования.

Способ морфологической диагностики алюминоза (бокситового пневмокониоза) на материале резекций или биопсийном материале легких и лимфатических узлов, отличающийся тем, что наличие алюминия в пылевых частицах определяют с помощью микроскопа по свечению оранжевого цвета в поляризованном свете.


Ссылка на основную публикацию
Советы при непроходимости кишечника у новорожденных и грудных детей
Незавершенный поворот кишечника у новорожденных ВОЗРАСТ И КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ СИНДРОМА ЛЕДДА (НЕЗАВЕРШЕННОГО ПОВОРОТА КИШЕЧНИКА) У НОВОРОЖДЕННЫХ Синдром Ледда (незавершенный поворот...
Снижение либидо при беременности новая жизнь пары
Либидо при беременности В отношении секса и либидо при беременности возникает множество вопросов, вызванных существующими предрассудками. Многие представительницы прекрасного пола...
Снова роды второй раз уже не страшно — новости Челябинска
Счастье через муки: приморский врач рассказала, почему женщинам больно рожать И испытывают страх. Почему женщинам страшно рожать? И как они...
Советы проктолога Статьи медицинского центра Медклиник
Складка на анальном отверстии Среди неприятных и опасных заболеваний особое место занимают кондиломы и бахромки прямой кишки. Помимо физического дискомфорта...
Adblock detector